Uma ligação entre a sinalização de agrina e Cav3.2 na junção neuromuscular na atrofia muscular espinhal

May 01, 2023

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 18960 (2022) Citar este artigo

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A deficiência da proteína SMN causa atrofia muscular espinhal (SMA). As terapias baseadas em SMN melhoram os sintomas motores do paciente em graus variáveis. Uma característica inicial da SMA é a perturbação da junção neuromuscular (NMJ), uma sinapse entre um motoneurônio e uma célula muscular. A formação de NMJ depende do agrupamento de receptores de acetilcolina (AChR) desencadeado por agrina e seus co-receptores proteína relacionada ao receptor de lipoproteína 4 (LRP4) e via de sinalização da quinase específica do músculo transmembrana (MuSK). Mostramos anteriormente que a flunarizina melhora NMJs em camundongos modelo SMA, mas os mecanismos permanecem indefinidos. Mostramos aqui que a flunarizina promove o agrupamento de AChR em células autônomas, dependentes da dose e da agrina em miotubos C2C12. Isso está associado a um aumento nos níveis de proteína de LRP4, integrina-beta-1 e alfa-distroglicano, três co-receptores da agrina. Além disso, a flunarizina aumenta a interação MuSK com integrina-beta-1 e fosfotirosinas. Além disso, a droga atua na expressão e splicing dos genes Agrn e Cacna1h de maneira músculo-específica. Nós revelamos que a proteína Cav3.2 codificada por Cacna1h associa-se intimamente in vitro com o co-receptor de agrina LRP4. In vivo, é enriquecido nas proximidades de NMJs durante o desenvolvimento neonatal e a droga aumenta essa imunomarcação nos músculos SMA. Assim, a flunarizina modula os principais atores do NMJ e identifica Cav3.2 como uma nova proteína envolvida na biologia do NMJ.

A atrofia muscular espinhal (AME) é caracterizada pela degeneração dos motoneurônios espinhais e atrofia muscular. A SMA é causada por mutações no gene do neurônio motor de sobrevivência 1 (SMN1) levando à redução dos níveis da proteína SMN1,2. Esta proteína é uma proteína de ligação ao DNA/RNA expressa ubiquamente envolvida na regulação da expressão gênica, incluindo transcrição, splicing, transporte e tradução do RNA, sendo a função mais caracterizada o seu papel na biogênese das pequenas ribonucleoproteínas nucleares ricas em U (snRNPs)3, 4,5. Em humanos, a presença de uma cópia do gene SMN2 fornece uma proteína menos totalmente funcional devido a um splicing alternativo do último exon 76 de codificação. Assim, fenótipos SMA mais brandos são observados quando o número de cópias do gene SMN2 aumenta7,8. As terapias SMA aprovadas são dedicadas a aumentar os níveis de proteína SMN usando terapia genética SMN ou direcionando o pré-mRNA SMN2 com um oligonucleotídeo antisense (ASO) ou uma pequena molécula. Apesar desses enormes avanços científicos e clínicos, muitos pacientes não conseguem tomar esses medicamentos, outros respondem mal e, por vezes, observam-se efeitos adversos9,10,11,12,13. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à doença deve contribuir para o surgimento de melhores terapias de importância clínica.

Defeitos da junção neuromuscular (NMJ) foram observados na patogênese da SMA antes da perda de motoneurônio consistente com um fenótipo "dying-back"14,15,16. De fato, maturação atrasada, área menor da placa terminal e desnervação da placa terminal são detectadas em camundongos modelo SMA17,18,19. Uma marca registrada dos MNJs é o agrupamento de receptores musculares de acetilcolina (AChRs) na membrana muscular pós-sináptica mediada pela agrina secretada pelos motoneurônios20. A agrina se liga ao receptor LRP4 e então, o complexo agrina-LRP4 se liga e ativa a transmembrana MuSK promovendo o agrupamento de AChR por meio de adaptadores como a proteína de docking 7 (Dok7)21,22. Além disso, camundongos sem os genes Agrn, Lrp4 ou Musk funcionais morrem no período perinatal.

O gene Agrn produz múltiplas isoformas em vários tecidos usando dois promotores e splicing alternativo de éxons que codificam domínios do terminal C, como os sítios Y e Z23,24,25. Os primeiros éxons alternativos codificam os terminais N secretores (NtA) ou transmembranares (Tm), sendo estes últimos expressos principalmente em neurônios, enquanto o NtA também é expresso em células não neurais, como músculos26. As isoformas neurais de agrina Z+ agrupam fortemente os AChRs em comparação com a Z- agrina muscular23. Como componentes da matriz extracelular (MEC), as agrinas também se ligam à laminina, heparina, α-distroglicana e integrinas β127,28. Assim, a agrina também está envolvida em uma variedade de funções: mantém o NMJ29, promove a regeneração do coração30, inibe o alongamento de neurites31,32,33, regula a sinaptogênese no sistema nervoso central34 e coordena um crosstalk entre as vias LRP4/MuSK e integrina-β1 em câncer de fígado35,36.